Στα τέλη του 1906 προσκλήθηκε να αναλάβει την εκπαίδευση μιας ομάδας παιδιών σε μια φτωχογειτονιά της Ρώμης, το Σαν Λορέντζο. Η Μοντεσόρι το θεώρησε ως χρυσή ευκαιρία για την εφαρμογή των εκπαιδευτικών της μεθόδων σε παιδιά με φυσιολογική νοημοσύνη. Στις 6 Ιανουαρίου 1907 άνοιξε το πρώτο Σπίτι των Παιδιών (Casa dei Bambini). Έδινε ιδιαίτερη έμφαση στα εποπτικά διδασκαλίας δικής της εμπνεύσεως και κατασκευής για να γίνονται μέσω των αισθήσεων κατανοητά τα μαθήματα του σχολείου. Οι μαθητές μάθαιναν στην αυτοπειθαρχία μέσα από διάφορες δραστηριότητες, όπως το ξεσκόνισμα και το σκούπισμα της τάξης και την περιποίηση του κήπου.

Στην πρώτη αυτή πειραματική σχολική τάξη η Μοντεσόρι παρακολουθούσε καθημερινά τις αντιδράσεις των παιδιών, για να διαμορφώσει την εκπαιδευτική της μέθοδο, η οποία αποτυπώνεται στο βιβλίο της Η μέθοδος της επιστημονικής παιδαγωγικής (Il Metodo della Pedagogia Scientifica Applicato All’ Educazione Infantile Nelle Casa Dei Bambine), που εκδόθηκε το 1909. Η Μοντεσόρι εμπνεύστηκε τη μέθοδό της από τα νηπιαγωγεία του Φρέμπελ, την ψυχολογία των αισθήσεων των Ιτάρ και Σεγκέν και τις εκπαιδευτικές θεωρίες του Πεσταλότσι.

Σύμφωνα με τη μέθοδο Μοντεσόρι, το παιδί συμμετέχει στη γνώση και με τις πέντε αισθήσεις του και εκπαιδεύεται χωρίς σχολικούς καταναγκασμούς. Διάφορα αντικείμενα το βοηθούν να κατανοήσει τις έννοιες του βάρους, τα χρώματα, τα ποσοτικά μεγέθη και τα σχήματα, ενώ διάφορες κατασκευές αξιοποιούν τη δημιουργική και καλλιτεχνική του έφεση. Η παιδαγωγός δεν επιβάλλεται ποτέ με τον φόβο ή με την ένταση της φωνής της. Ένα «μάθημα σιωπής» ασκεί στον αυτοέλεγχο και την αυτοσυγκράτηση τα παιδιά.

Το εκπαιδευτικό της σύστημα αρχίζει να αναγνωρίζεται πρώτα στην Ιταλία και στη συνέχεια στον υπόλοιπο κόσμο. Τα επόμενα σαράντα χρόνια ταξιδεύει αδιάκοπα σε όλη την Ευρώπη, την Ινδία και τις ΗΠΑ, ανοίγοντας σχολεία που φέρουν το όνομά της. Το πρώτο μοντεσοριανό νηπιαγωγείο στην Ελλάδα άνοιξε το 1936 στην Αθήνα από την ελληνορωσίδα εκπαιδευτικό Μαρία Εντελστάιν-Γουδέλη (1906-1991), με τη βοήθεια του παιδαγωγού Δημήτρη Γληνού. Είναι η σημερινή Μοντεσοριανή Σχολή Αθηνών «Μαρία Γουδέλη», που εδρεύει στη Νέα Φιλοθέη.

Το 1922, η Μαρία Μοντεσόρι διορίζεται κυβερνητικός επιθεωρητής των Σχολείων στην Ιταλία, αλλά θα αναγκαστεί να εγκαταλείψει τη χώρα της το 1934, εξαιτίας της φασιστικής διακυβέρνησης Μουσολίνι. Μετακομίζει στην Ισπανία, αλλά μετά τον Εμφύλιο και την επικράτηση της δικτατορίας του Φράνκο εγκαθίσταται στην Ολλανδία. Το 1939 μεταναστεύει στην Ινδία, όπου θα παραμείνει καθ’ όλη τη διάρκεια του Β’ Παγκοσμίου Πολέμου. Το 1949 επιστρέφει στην Ολλανδία, όπου θα ζήσει μέχρι το τέλος της ζωής της. Στις 6 Μαΐου 1952, εξαιτίας ενός εγκεφαλικού επεισοδίου, αφήνει την τελευταία της πνοή στην πόλη Νόρντβαικ της Δυτικής Ολλανδίας, σε ηλικία 81 ετών.